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　  ELISA的五種實(shí)驗(yàn)原理及常見問題分析

　　一，簡(jiǎn)介

　　酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)寫ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙x等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。

　　二，實(shí)驗(yàn)原理

　　主要有 5 種方法：雙抗夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、直接法、間接法、捕獲法

　　(1)雙抗夾心法：適用于大分子物質(zhì)的檢測(cè)。將已知的可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙x等固相載體表面，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法,具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

　　(2)競(jìng)爭(zhēng)法：競(jìng)爭(zhēng)法適用于較少表位的小分子物質(zhì)。將抗體包被于微孔板中，加入無關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點(diǎn)，加入標(biāo)準(zhǔn)品和生物素標(biāo)記的抗原物質(zhì)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。

　　(3)直接法：主要用于抗原的檢測(cè)，將抗原直接固定在固相載體上，洗滌后加入酶標(biāo)特異性抗體，洗滌后加入底物顯色，該方法對(duì)抗體的特異性要求較高。

　　(4)間接法：主要用于抗體的檢測(cè)。將特異性抗原包被在固相載體表面，與標(biāo)本中相應(yīng)特異性抗體結(jié)合，洗滌后加入酶標(biāo)的抗體，洗滌后加入底物顯色。該方法對(duì)抗原的特異性要求較高。

　　(5)捕獲法：捕獲法主要用于血清中某種抗體亞型的檢測(cè)。先將針對(duì) IgM的第二抗體連接與固相載體，用以結(jié)合樣品中的所有 IgM，洗滌除去 IgG等無關(guān)的物質(zhì)，然后加入特異性抗原與待檢 IgM結(jié)合，再加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物顯色即可對(duì)樣品中待檢 IgM是否存在及其含量進(jìn)行測(cè)定。

　　三，實(shí)驗(yàn)步驟(以雙抗夾心法為例)

　　(1)準(zhǔn)備好需要的標(biāo)準(zhǔn)品和試劑

　　(2)向孔中加入100ul標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本

　　37℃孵育2小時(shí), 然后洗板3次

　　(3)每孔加100ul生物素化抗體工作液

　　37℃孵育1小時(shí), 然后洗板3次

　　(4)每孔加100ul鏈霉親和素-HRP工作液

　　37℃孵育0.5小時(shí), 然后洗板3次

　　(5)加入100ul 底物溶液，37℃避光，孵育15-20分鐘

　　(6)加入50ul終止液

　　(7)5min內(nèi)檢測(cè)450nm波長(zhǎng)的OD值

　　校正波長(zhǎng)設(shè)置為570nm或630nm

　　(8)導(dǎo)出數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

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